МЕТОДИКА
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИННАМИЛГЛИКОЗИДОВ
В КОРНЯХ РОДИОЛЫ РОЗОВОЙ МЕТОДОМ ВЭЖХ к.х.н. В. Пунегов
Научные интересы: химия и технология биологически активных веществ, интродукция лекарственных растений И. Захожий
Научные интересы: физиология и биохимия растений Родиола розовая (Rhodiola rosea L.) – многолетнее травянистое растение из семейства толстянковых. Имеет широкий евразийский дизъюнктивный аркто-высокогорный ареал. Изолированные участки ареала находятся в горах Скандинавии, Западной Европы, Балканского п-ова, Кавказа, Малой Азии, Средней Азии, Монголии, Китая, Японии; на территории России – в горах севера европейской части, Сибири, Дальнего Востока. Препараты родиолы розовой с давних пор используются в народной и традиционной медицине. Экстракт корней и корневищ обладает адаптогенным свойством, повышает устойчивость организма к действию неблагоприятных факторов химической, биологической и физической природы. В научной медицине препараты золотого корня рекомендуется применять как стимулирующее средство практически здоровым людям при переутомлении, больным с различными формами неврозов, при вегетососудистой дистонии, гипотонии и в психиатрической практике, кроме того, в период выздоровления после тяжелых заболеваний. Свойства стимулятора центральной нервной системы, адаптогенный и антиоксидантный эффекты спиртового экстракта корневищ родиолы розовой обусловлены гликозидами (рис. 1) транс-коричного спирта (циннамилгликозиды: розин, розавин, розарин) и тирозола (салидрозид). Стандартизацию биомассы родиолы розовой и препаратов на ее основе предложено осуществлять по содержанию розавина и салидрозида [3]. В институте биологии Коми НЦ УрО РАН родиола розовая изучается более 10 лет. За это время проведены исследования биологических особенностей этого растения, выявлены экологические ниши, изучен возрастной состав выявленных ценопопуляций, проведено описание биоморфологических особенностей растений в местах естественного произрастания. Собран исходный посевной материал, заложен коллекционный питомник, в условиях культуры изучены морфологические, эколого-физиологические и онтогенетические особенности родиолы [1, 2]. Однако, несмотря на имеющиеся успехи в изучении и интродукции родиолы розовой остается не выясненным вопрос о содержании биологически активных веществ (БАВ) в исследуемых популяциях. В связи с этим нам представлялось целесообразным проведение работы, направленной на усовершенствование известных методик количественного ВЭЖХ анализа циннамилгликозидов (ЦГ) и салидрозида, а также выделение препаративных количеств розавина и салидрозида, необходимых для калибровки аналитического оборудования. Для выделение индивидуальных гликозидов розавина и салидрозида (рис. 2) в качестве растительного сырья использовали корни и корневища родиолы розовой. Отбор растительного сырья осуществлен осенью 2001 г. на опытных делянках ботанического сада Института биологии. Измельченную биомассу доводили до воздушно-сухого состояния, применяя сушку при 75 °С. Извлечение экстрактивных веществ корней и корневищ осуществляли трехкратной экстракцией 70 % этиловым спиртом в соотношении сырье/экстрагент равном 1:10 (первичную – 12 часов при комнатной температуре, вторичную – 1 час при температуре 45 °С, третичную – 30 минут при температуре 60 °С). Объединенный экстракт фильтровали и упаривали на роторном испарителе до водного остатка. К водному остатку приливали рассчитанный объем 15 % раствора ацетата свинца. При этом наблюдалось выпадение хлопьевидного осадка. Таким образом, из раствора были удалены белки и некоторые фенольные соединения (флавонолы, производные галловой кислоты и т.п.). Осадок центрифугировали и промывали водой. Супернатант, объединенный с промывными водами, обрабатывали 5 % раствором сульфата натрия для удаления избытка ацетата свинца. Полученный раствор фильтровали и упаривали в вакууме. Сиропообразную массу пятикратно экстрагировали свежими порциями н-бутанола. В водном слое остается большая часть моно-, ди-, олигосахаридов, соли и другие сильно полярные компоненты. Бутанольный слой, обогащенный ЦГ и салидрозидом, высушивали на роторном испарителе и обрабатывали гексаном для удаления эфирных масел и малополярной компоненты. Фракцию веществ, обогащенную ЦГ и салидрозидом, упаривали до воздушно-сухого состояния, растворяли в минимальном объеме воды и наносили на хроматографическую колонку размером 250x35 мм, заполненную сорбентом "Диасорб 130-С16-Т" 60-160 нм. Изоляцию целевых веществ осуществляли последовательным элюированием дистиллированной водой, 6, 10, 12 и 15 % этиловым спиртом. Элюат собирали в виде отдельных фракций по 25 см3 каждая. Фракции, содержащие розавин и салидрозид, подвергали рехроматографированию. В качестве элюентов применяли растворы этилового спирта. Найдено на основании ВЭЖХ анализа, что салидрозид и розавин элюируются соответственно 6 и 15 % этанолом. Анализ продуктов колоночной хроматографии осуществляли на микроколоночном хроматографе "Миллихром", оснащенном УФ-детектором при 254 нм (максимум поглощения циннамилгликозидов) и 276 нм (максимум поглощения салидрозида); колонка КАХ-2 размером 64x2 мм, заполненная сорбентом Silasorb C 18. Условия ВЭЖХ анализа: элюент – вода – метанол 70:30 (объемные доли); скорость подачи элюента – 50 мкл/мин; объем вводимой пробы – 3 мкл; диапазон чувствительности детектора – 0.16 ед. опт. пл. Время удерживания веществ: салидрозид – 5.1, розавин – 17 мин. Регистрацию хроматографической информации и обработку результатов осуществляли с помощью универсальной компьютерной системы сбора и обработки хроматографической информации "Полихром для Windows" (рис. 3). Идентификацию структуры выделенных веществ осуществляли методом спектроскопии D-ЯМР 13С на приборе "Bruker DRX-400" в лаборатории ЯМР-спектроскопии Института органического синтеза (г. Екатеринбург). Условия анализа: рабочая частота 100.61 Гц, растворитель DMSO-d6. Сопоставление теоретических и практических данных ЯМР-спектроскопии (рис. 4) подтверждает аутентичность структур выделенных веществ. Полученные данные свидетельствуют, что содержание основного компонента в выделенных образцах не менее 95 %, и они вполне пригодны для калибровки аналитической аппаратуры. Практический выход салидрозида и розавина при использовании предложенной методики выделения не уступает данному показателю для методик, описанных в литературе, и составляет 0.47 и 0.54 % массы воздушно-сухого сырья соответственно. В настоящее время в качестве метода количественного анализа гликозидов родиолы розовой предложено применение обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако известные методики характеризуются рядом недостатков, основным из которых является отсутствие стадии предварительной подготовки проб экстрактивных веществ. Подготовка проб экстракта родиолы сводиться зачастую только к разбавлению водой в определенной пропорции, что отрицательно отражается как на селективности хроматографического разделения ЦГ, так и на ресурсе хроматографических колонок. Одним из способов решения данной проблемы является применение очистки анализируемых растворов методом твердофазной экстракции. Отделение суммы ЦГ и салидрозида от сопутствующих веществ осуществляли твердофазной экстракцией (ТФЭ) гликозидов на гидрофобном сорбенте Диасорб С16 Т путем фильтрации образца пробы (150 мг) экстракта родиолы розовой, после выпаривания спирта, через концентрирующий патрон (насыпной объем сорбента в патроне 1 см3). Фильтрат, содержащий сахара и соли, отбрасывали. Салидрозид и ЦГ элюировали с сорбента в патроне 30 %-ным метанолом (15 см3). Контроль полноты элюирования гликозидов с патрона осуществляли с помощью ВЭЖХ. Фильтрат, содержащий салидрозид и ЦГ, разводили в мерной колбе на 25 см3 до метки. Подготовленную пробу экстракта анализировали методом ВЭЖХ. В тех же условиях проводили ВЭЖХ-анализ пробы, полученной в результате растворения первичного сухого экстракта элюентом в пропорции 1:250. Полученные пробы анализировали в одинаковых условиях. Условия ВЭЖХ-анализа (см. выше). Время удерживания веществ: салидрозид – 5.1, розарин – 15.0, розавин – 17.0, розин – 18.6 мин (рис. 5). Установлено, что предложенный способ концентрирования и очистки от сопутствующих веществ проб экстракта корневищ родиолы розовой методом ТФЭ является в настоящее время одним из наиболее эффективных приемов увеличения селективности определения ЦГ и салидрозида и ресурса аналитических колонок для ВЭЖХ. Содержание в пробах экстракта суммы ЦГ и салидрозида в результате пробоподготовки увеличивается в пересчете на сумму экстрактивных веществ в 1.7 раза. Хроматографическое разрешение Rs пиков розавина и розина (вычисленное по формуле Rs = 2·DТ/(w1 – w2), где DТ – разность времен удерживания розина и розавина (с), w1 – ширина хроматографического пика розавина в его основании (услов. с), w2 – ширина хроматографического пика розина в его основании (услов. с) до пробоподготовки составляло 0.62, а после – 1.25. Следовательно, подготовка проб экстракта корневищ родиолы розовой позволяет не только повысить в два раза разрешение хроматографических пиков розавина и розина, а значит и селективность определения ЦГ, но и уменьшить время хроматографического анализа, повысить в 2-3 раза ресурс аналитической хроматографической колонки КАХ-2. Количественное определение ЦГ и салидрозида осуществляли на жидкостном микроколоночном хроматографе "Милихром" с привлечением метода градуировочной зависимости совместно с внутренним стандартом, используя рабочие стандартные образцы гликозидов, выделенные обращенно-фазовой хроматографией низкого давления. С целью построения градуировочных графиков смесь гликозидов (100 мг, содержащую по 50 мг салидрозида и розавина) и 50 мг п-гидрокси-м-метокси-бензальдегида (внутренний стандарт) растворяли в 100 см3 дегазированного 30 % метанола (раствор А). Затем путем последовательного разбавления раствора А элюентом готовили градуировочные растворы гликозидов с концентрациями 0.05-0.5 мг/см3 с шагом 0.1. Каждый раствор хроматографировали не менее трех раз при длинах волн 254 и 274 нм. Условия хроматографирования приведены выше. На основании полученной хроматографической информации с помощью программы "Полихром" рассчитывали градуировочные коэффициенты – коэффициенты пропорциональности между соотношением площадей пиков и концентраций салидрозида, розавина (рис. 6) и внутреннего стандарта. Случайная погрешность измерения содержания гликозидов при проведении трех повторных измерений не превышает вблизи нижней границы диапазона измерений (0.10 мг/см3 определяемого гликозида) 15 %; в середине диапазона измерений (0.25 мг/см3 определяемого гликозида) 6 %; вблизи верхней границы диапазона измерений (0.50 мг/см3, где А1 и А2 – коэффициенты, учитывающие объем исходного экстракта, аликвоту определяемого гликозида) 3 %. Для расчета содержания определяемых компонентов Хi (%) использовали формулу: , где А1 и А2 – коэффициенты, учитывающие объем исходного экстракта для концентрирования гликозидов на патроне и объем пробы для ВЭЖХ; Кi – калибровочный коэффициент гликозида; Si – интегральная интенсивность хроматографического сигнала гликозида; Sc – интегральная интенсивность хроматографического пика ВС, мВ·с; а – навеска растительного сырья, мг; mc – масса ВС в пробе, мг. Применение метода градуировочной зависимости совместно с внутренним стандартом для ВЭЖХ-анализа сложных по составу образцов экстрактивных веществ позволяет повысить точность количественного определения индивидуальных соединений. Кроме того, метод ВС исключает появление ошибок анализа, связанных с вариацией объемов проб, вводимых в колонку для ВЭЖХ. Следует особо отметить, что именно вариации объемов проб, обусловленные конструкцией хроматографов марки «Милихром», делают эти приборы малопригодными для анализа с использованием методов абсолютной градуировки или внешнего стандарта. В то же время они вполне пригодны для массовых анализов с применением метода ВС. В настоящей работе в качестве внутреннего стандарта предлагается использовать п–гидрокси–м–метокси–бензальдегид, содержащий фенильный хромофор с одним из максимумов полосы поглощения в области 278-280 нм, что практически совпадает с максимумом полосы поглощения хромофора салидрозида (274 нм). Максимум полосы поглощения хромофора розавина располагается в области 252-254 нм, что соответствует участку «плеча» одного из максимумов полосы поглощения хромофора внутреннего стандарта. В целом представленная методика обращенно-фазового ВЭЖХ-анализа БАВ родиолы розовой характеризуется достаточной точностью, высокой чувствительностью (предел обнаружения салидрозида и розавина не превышает 0.05 мг/см3) и селективностью определения. Результаты данных исследований позволят получить сведения о физиолого-биохимических особенностях накопления вторичных метаболитов родиолы розовой, выращиваемой в культуре, и могут быть использованы при разработке и оценке агротехнических приемов возделывания данного вида, а также для технологического контроля при производстве фармацевтических препаратов, содержащих БАВ родиолы розовой. ЛИТЕРАТУРА 1. Далькэ И.В., Головко Т.К. Оптимальная температура и освещенность для фотосинтеза толстянковых на севере (на примере Rhodiola rosea L.) // Вестн. Башкирского ун-та, 2001. № 2 (I). С. 29-31. – (Спецвыпуск: Матер. годичного собрания Всерос. об-ва физиологов растений). 2. Куркин В.А., Запесочная Г.Г. Химический состав и фармакологические свойства растений рода Родиола. // Хим.-фарм. журн., 1986. Т. 20. № 10. С. 1231. 3. Фролов Ю.М., Полетаева И.И. Родиола розовая на европейском северо-востоке. Екатеринбург, 1998. 192 с.
Логотип -
Начало -
Общие
сведения -
Структура -
Научная деятельность 4009 посещений с 25.12.2002 |