МЕТОДИКА
МЕТРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ И ГИДРОЛИЗАТОВ БЕЛКОВ НА СОДЕРЖАНИЕ АМИНОКИСЛОТ
МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ИОНООБМЕННЫХ СМОЛАХ
к.х.н. Е. Ванчикова, к.х.н. Б. Кондратенок, Л. Зубкова, Н. Жук
к.б.н. М. Шапошников
Образец растительных объектов содержит белки, которые при гидролизе распадаются на аминокислоты. Гидролизат белков может содержать до семнадцати аминокислот: аспаргиновую, треонин, серин, глутаминовую, пролин, цистин, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин. Разделение смеси на отдельные компоненты осуществляют на хроматографической колонке, заполненной ионообменной смолой "Ostion". Разделение аминокислот основано на различном сродстве отдельных аминокислот к иониту. Последовательность выхода отдельных составляющих смеси из колонки определяется свойствами ионита, температурой системы и составом элюента – буферного раствора переменного состава. Количество каждой аминокислоты в элюате определяют фотометрически по поглощению при l = 520 нм окрашенного в фиолетовый цвет соединения, образующегося в результате постколоночной реакции аминокислоты с нингидрином. Хроматограмма аминокислот, полученная на анализаторе ААА 339 с использованием буферных растворов с рН 2.90; 4.25; 7.90, приведена на рис. 1. Содержание аминокислоты в гидролизате белков измеряют методом сравнения интегральных интенсивностей хроматографических пиков аминокислоты, полученных для раствора с неизвестным содержанием данной кислоты и для аттестованной смеси аминокислот с известным ее содержанием. Причем для всего диапазона измерений содержания аминокислот в гидролизате в качестве раствора сравнения используют одну и ту же аттестованную смесь с содержанием аминокислот, соответствующим середине исследуемого диапазона. Исследование гидролизатов белков Причины погрешности измерения содержания аминокислот, связанные непосредственно с хроматографическим методом анализа, были выявлены с использованием модельных гидролизатов белков – водных растворов аминокислот. Из реактивов, высушенных при температуре 80.0±1.0 °С до постоянной массы, приготовили солянокислый раствор с молярной концентрацией каждой из аминокислот 2.5 мкмоль/см3. Путем разбавления исходной смеси лимоннокислым буферным раствором получили пять растворов с содержанием аминокислот в диапазоне от 0.15 до 1 мкмоль/см3 и провели их анализ в условиях внутрилабораторной воспроизводимости не менее 17 раз. По алгоритму, предложенному в работе [1], оценили характеристики погрешности: среднеквадратичное отклонение случайной составляющей погрешности; границы симметричных интервалов, в которых систематическая составляющая и результирующая погрешности находятся с вероятностью Р = 0.95 (табл. 1). В результирующую погрешность измерения содержания аминокислот данным методом вносят вклад как случайная, так и систематическая ее составляющие. Случайная составляющая погрешности имеет мультипликативный характер (рис. 2.1) и зависит от чувствительности фотометрической реакции аминокислоты с нингидрином и времени выхода компонента из хроматографической колонки. Чувствительность фотометрической реакции аминокислот с нингидрином характеризует коэффициент К, связывающий интегральную интенсивность хроматографического пика J с молярной концентрацией аминокислоты в растворе: J = KґC(X). Чем меньше данный коэффициент, тем ниже чувствительность реакции. Для большинства аминокислот он имеет значение от 3·104 до 4·104 см3/мкмоль. Для кислот с близкими значениями К, выходящих из хроматографической колонки первыми (аспаргиновая, треонин, серин, глутаминовая), среднеквадратичное отклонение случайной составляющей относительной погрешности измерения их содержания в среднем равна ±4 %. Для пролина, выходящего следом за вышеперечисленными аминокислотами и имеющего К = 0.53·104, характеристика случайной составляющей погрешности резко возрастает до ±11%. Подобная взаимосвязь коэффициента К и наблюдается и для измерения содержания цистина (К = 1.93·104, = ±7 %). Так же четко прослеживается связь характеристики случайной составляющей погрешности с последовательностью выхода аминокислот из хроматографической колонки. Методике измерения содержания аминокислот в водных растворах можно приписать значение среднего квадратичного отклонения случайной составляющей погрешности для первых компонентов: аспаргиновой кислоты, треонина, серина, глутаминовой кислоты, глицина, аланина, валина, метионина, изолейцина – ±4 %; для второй группы: лейцина, тирозина, фенилаланина – ±6 %; для трех последних: гистидина, лизина, аргинина – ± 8%. При расчете систематической составляющей погрешности измерения содержания аминокислот в растворе учитывали три составляющие: математическое ожидание, погрешность средств измерения, погрешность аттестованного значения молярной концентрации аминокислот в анализируемых смесях. Закономерна зависимость математического ожидания систематической составляющей погрешности измерения от содержания аминокислот в растворе, характеризующего правильность оценки значений молярного коэффициента погашения (рис. 2.2). Наименьшее отклонение результата анализа от аттестованного значения содержания аминокислот в растворах наблюдается в центре исследованного диапазона, вблизи реперного значения 2.5 мкмоль. По мере удаления от центра диапазона погрешность оценки коэффициента погашения увеличивается, что приводит к повышению расхождения между измеренным и аттестованным значениями содержания аминокислот в аттестованных смесях. Однако основной вклад в систематическую составляющую погрешности измерения содержания аминокислот в растворе вносит погрешность средств измерений, которая одинакова для исследованного диапазона концентраций и всех аминокислот. Поэтому методике анализа белковых гидролизатов можно приписать значение систематической составляющей погрешности равное ±7 %, независящее от природы компонента. Экспериментальные значения границ интервалов, в которых случайная, систематическая составляющие и результирующая погрешность находятся с вероятностью Р = 0.95, представлены на рис. 3. Параболическая зависимость характеристик погрешности от содержания аминокислот в растворах с минимумом при реперном значении концентрации компонента (0.5 мкмоль/см3) явная для систематической, прослеживается и для случайной составляющей и результирующей погрешности. Исследование стандартных растительных образцов В лаборатории "Экоаналит" Института биологии Коми НЦ УрО РАН имеются два стандартных образца: состава злаковой травосмеси (СО № 1) и клубней картофеля (СО № 2), аттестованные на содержание в них аминокислот. Методика количественного химического анализа растительных образцов на содержание аминокислот отличается от анализа гидролизатов на одну стадию: гидролиз белков. Однако процесс обработки растительных объектов раствором хлороводородной кислоты при нагревании в запаянных ампулах может привести к дополнительным погрешностям из-за деструкции аминокислот. Чтобы выяснить вклад процедуры гидролиза белков в погрешность измерения содержания аминокислот в растительных образцах, проведен количественный химический анализ стандартных образцов на содержание 17 аминокислот в условиях внутрилабораторной воспроизводимости 23 раза. Содержание аминокислот в стандартных образцах колеблется от 0.05 для цистина до 2.42 % для глутаминовой кислоты (табл. 2). Так как анализ образца проводят одновременно на содержание семнадцати компонентов, навески выбраны таким образом, чтобы в гидролизате молярная концентрация большинства аминокислот соответствовала исследованному ранее диапазону: m1 = 50.00 мг, m2 = 100.00 мг для СО № 1 и № 2 соответственно. Объем буферного лимоннокислого раствора, в котором растворили сухую смесь аминокислот, полученную после гидролиза растительных белков, составляет 5.00 см3. Содержание цистина в растительных белках, как правило, мало по сравнению с другими аминокислотами, поэтому его молярная концентрация в белковом гидролизате оказалась ниже предела обнаружения. Для устойчивых к нагреванию компонентов (аспаргиновой кислоты, треонина, серина, глицина, аланина и валина) характеристика погрешности измерения их содержания в растительных образцах увеличилась только на 1ё2 %, а изолейцина, лейцина и лизина – на 3ё5 % по сравнению с методикой анализа водных растворов. Значительное увеличение характеристики погрешности измерения содержания пролина, метионина, тирозина, фенилаланина, гистидина, аргинина, учитывая их состав и строение, можно было предсказать заранее. Глутаминовая кислота устойчива к нагреванию, но содержание ее в растительных образцах выходит за верхнюю границу исследуемого диапазона и, следовательно, можно только предположить ход кривой зависимости погрешности измерения от содержания данной кислоты (рис. 4). Молярная концентрация метионина и гистидина в гидролизате белка травосмеси 0.15 и 0.22 мкмоль/см3 близка к нижней границе исследованного концентрационного диапазона, а в полученном из клубней картофеля 0.08 и 0.12 мкмоль/см3 – ниже предела обнаружения. Поэтому объяснимы погрешности измерения содержания неустойчивого к нагреванию метионина в образцах, превышающие 100 %, и d = ±40 % для гистидина. Контроль значимости математического ожидания систематической составляющей погрешности измерения массовой доли аминокислот в стандартных образцах проводили сравнением фактического расхождения аттестованного wСО и измеренного wизм значений массовых долей аминокислот |wизм – wСО| с их квадратичной суммарной погрешностью (табл. 3). Значение математического ожидания систематической составляющей погрешности значимо только для тех аминокислот, молярные концентрации которых в гидролизатах ниже 0.25 мкмоль/см3. Следовательно, для растительных образцов нижняя граница концентрационного диапазона должна быть смещена в сторону больших молярных концентраций аминокислот Смин(Х) > 0.25 мкмоль/см3.
Логотип -
Начало -
Общие
сведения -
Структура -
Научная деятельность 3829 посещений с 21.10.2002 |