ОБЗОР
МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК У DROSOPHILA MELANOGASTER
к.б.н. М. Шапошников
Научные интересы: радиационная генетика, молекулярная и клеточная радиобиология, малые дозы ионизирующей радиации Репарация или восстановление повреждений ДНК – фундаментальный процесс, свойственный всем существующим на Земле видам, от бактерий до человека. У Drosophila melanogaster на сегодняшний день описано около 50-ти мутаций, так или иначе затрагивающих процессы репарации ДНК [7]. Большинство из этих мутаций изучены также на молекулярном и биохимическом уровнях, что делает дрозофилу удобным объектом при исследовании роли репарации в формировании генетических эффектов на малые дозы облучения. Обычно репарация разных типов повреждений ДНК происходит в несколько последовательных этапов, имеющих свою специфику [2]. Первый этап репаративного процесса ведет к идентификации повреждения и определению его типа. Второй – к активации ферментов, которые или напрямую преобразуют повреждение до исходного состояния, или, если прямое восстановление невозможно, вырезают поврежденный участок. В последнем случае необходимо осуществление еще двух этапов – синтез нового участка ДНК и его встраивание в двойную цепочку. Считают, что при взаимодействии ионизирующего излучения с клеточными структурами повреждение ДНК представляет наиболее критическое для клетки и организма событие. Индукция повреждений ДНК происходит двумя путями: при непосредственном попадании ионизирующей частицы в молекулу ДНК и косвенно, через индукцию свободных радикалов [1]. Эти повреждения имеют неодинаковую природу. При прямом повреждении индуцируются модификации оснований, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, одно- и двунитевые разрывы ДНК [18]. Повреждения ДНК, индуцируемые косвенным способом, имеют природу, сходную со спонтанными нарушениями, и в основном представлены модифицированными основаниями и однонитевыми разрывами ДНК [23]. В зависимости от типа повреждения ДНК различают несколько основных механизмов репарации [2]. Эксцизионная репарация оснований необходима для коррекции модифицированных оснований, которые образуются при действии на ДНК свободных радикалов [2]. Именно этот тип нарушений образуется при косвенном повреждении ДНК ионизирующей радиацией. Эксцизионная репарация осуществляется в несколько этапов. На первом этапе поврежденное основание удаляется ДНК гликозилазами, далее сахар без основания (АП-сайт) вырезается АП-эндонуклеазами. На втором этапе образовавшаяся брешь размером в одно основание восстанавливается до исходной последовательности с помощью совместного действия экзонуклеаз, полимеразы и ДНК лигазы [2]. У Drosophila melanogaster из ферментов эксцизионной репарации оснований обнаружено присутствие активной урацил ДНК гликозилазы в клетках эмбрионов, в яйцах и личинках третьего возраста [6]. АП-эндонуклеазная активность отмечена у рибосомальных белков S3 [28], и PO [31] которые кодируются генами RpS3 и RpPO соответственно. АП-эндонуклеазной активностью обладает также продукт гена Rrp1 [17, 20]. Кроме того, белки с эндонуклеазной активностью используются некоторыми ретропозонами при интеграции в новый сайт [10, 27]. Важную роль в процессе инициации ферментов эксцизионной репарации оснований играет белок поли(АДФ-рибозо) полимераза (ПАРП). Еще до активации ферментов репарации ПАРП связывается с разрывом и предотвращает свободные концевые участки ДНК от деградации [12]. Кроме того, поли(АДФ-рибозо) полимераза, наряду с ДНК-зависимой протеинкиназой (ДНК-ПК) и белком АТМ, участвует в обеспечении задержки клеточного цикла, которая необходима для завершения процесса репарации. Репарация однонитевых разрывов ДНК осуществляется последовательным действием 3'-фосфодиэстеразы, ДНК-полимеразы b и ДНК-лигазы [18]. Восстановление однонитевого разрыва ДНК происходит с использованием в качестве матрицы комплиментарной цепочки ДНК. Репарация данного типа повреждений может также происходить с участием механизма эксцизионной репарации нуклеотидов [2, 12]. Двунитевые разрывы являются самым опасным для клетки типом повреждений ДНК. Они приводят к развитию мутаций и хромосомных перестроек, гибели клеток и формированию генетической нестабильности [19]. У многоклеточных всего один нерепарированный двунитевый разрыв может убить клетку. Существуют, по меньшей мере, два различных пути для репарации этого типа повреждений: негомологичное воссоединение разорванных концов и гомологичная рекомбинация [32]. Негомологичное воссоединение происходит между концами ДНК, которые имеют негомологичные последовательности или очень короткие гомологичные районы. Этот тип репарации не безошибочен и часто является источником генетических перестроек [30]. Восстановление исходной структуры ДНК возможно только в том случае, если воссоединение происходит между концами одной и той же нити ДНК. Если процесс происходит между разными молекулами, он вызывает хромосомные аберрации, такие, как делеции, инсерции, транслокации и инверсии. У млекопитающих и дрожжей в процесс негомологичного воссоединения вовлечены Rad50 и родственные ему белки, факторы Ku, ДНК-лигаза IV и факторы сайленсинга [30]. У дрозофилы этот путь репарации осуществляется c участием продуктов генов mus104+ и mus101+ [7]. Процесс гомологичной рекомбинации у Drosophila melanogaster наиболее изучен на примере репарации двунитевых разрывов ДНК, вызванных транспозициями P-элемента. Двунитевый разрыв возникает на первом этапе транспозиции, при эксцизии элемента из донорского сайта [15]. На одной из нитей ДНК при этом образуется брешь, равная размеру мобильного элемента. Восстановление этого повреждения происходит с участием копии P-элемента на сестринской хроматиде, используемого в качестве матрицы для репаративного синтеза [16]. Ключевая роль в этом процессе отводится белку IRBP, родственному 70 кДа субъединице аутоиммунного антигена Ku человека [3]. IRBP специфически связывается с внешней частью концевого инвертированного повтора P-элемента, что предотвращает его разрушение и обеспечивает запуск процесса репарации [22]. Кроме того, после транспозиции P-элемента в донорском сайте остается несколько нуклеотидов [15]. Для их удаления необходима экзонуклеаза. Предполагают, что у дрозофилы в этом процессе участвует продукт гена mei-9+ [26]. Восстановление двунитевых разрывов завершается репаративным синтезом ДНК с гомологичной матрицы и сшиванием нитей ДНК-лигазами. В репаративном синтезе необходимо участие ДНК полимеразы и фактора PCNA, который у дрозофилы кодируется геном mus209+ [14]. Недавно индукция процесса гомологичной рекомбинации обнаружена у облученных эмбрионов дрозофилы in vivo, однако, на молекулярном уровне этот процесс еще не исследован [8]. Интересно, что в некоторых случаях процесс рекомбинационной репарации может происходить даже при нарушении контролирующих его генов. Как показано на дефицитных по рекомбинации мутантах Saccharomyces cerevisiae, репарация двунитевых разрывов ДНК происходит с помощью инсерции комплиментарной ДНК, образовавшейся при обратной транскрипции с РНК-последовательности ретроэлемента Ty1 [24]. Пока этот путь репарации, названный инсерционной репарацией, не обнаружен у многоклеточных организмов, однако у дрозофилы возможен другой путь «исцеления» двунитевых разрывов ДНК с помощью ретроэлементов. Показано, что теломерные ретроэлементы Het-A и TART дрозофилы могут перемещаться на свободные концы поврежденной ДНК и препятствовать их дальнейшей деградации [25]. Таким образом, в клетке существуют системы репарации, которые распознают и восстанавливают различные типы радиационно-индуцированных повреждений ДНК. В то же время при нарушении процессов репарации организмы могут иметь повышенную чувствительность к мутагенному действию различных факторов [2]. Поэтому использование таких организмов представляет особый интерес при исследовании эффектов облучения в малых дозах. При экспериментальном изучении эффектов хронического облучения в малых дозах мы использовали линии Drosophila melanogaster mei-9 и mei-41, характеризующиеся высокой чувствительностью к действию химических мутагенов и облучению [7]. Их повышенная радиочувствительность обусловлена тем, что линия mei-9a имеет нарушение механизма эксцизионной репарации нуклеотидов [4], а у линии mei-41D5 нарушен процесс пострепликативной репарации [5]. Кроме того, обе линии характеризуются дефектом процесса мейотической рекомбинации, что вызывает нарушение в контроле перемещений некоторых мобильных генетических элементов и поэтому представляют особый интерес при изучении эффектов малых доз облучения [9]. Результаты анализа уровня индукции рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) в линиях mei-9 и mei-41 после хронического гамма-облучения в малых дозах показывают, что частота индуцированных мутаций в линии mei-9 не изменяется при действии хронического облучения (см. таблицу). После хронического гамма-облучения в малых дозах частота индукции РСПЛМ у линии mei-9 не изменяется, а у линии mei-41 – достоверно снижается. Известно, что, в отличие от гена mei-9+, mei-41+ имеeт плейотропное действие и, кроме процессов репарации и рекомбинации, контролирует механизмы клеточного ответа на повреждения ДНК [22]. Аналогично ATM млекопитающих, mei-41+ обеспечивает задержку клеточного цикла в контрольной точке G2/M, активирует процессы репарации, а также предотвращает запуск программируемой гибели клетки [29]. Роль данных механизмов контроля клеточного ответа имеет большое значение не только для соматических тканей, но и для половых клеток. У млекопитающих мутация в гене ATM ведет к развитию стерильности, которая обусловлена остановкой мейоза сперматоцитов на стадии пахитены вследствие ненормального синапсиса хромосом [21]. У Drosophila melanogaster для многих мутантных аллелей mei-41 также характерна стерильность, связанная с гибелью половых клеток [11]. Возможно, что именно повышение уровня элиминации клеток с нарушениями ДНК обусловливает низкую частоту регистрации рецессивных мутаций у линии mei-41. Безусловно, что формирование повреждений ДНК может идти с участием мобильных генетических элементов, тем более, что мутация в гене mei-41 создает благоприятный фон для повышенного уровня транспозиций, как это показано в условиях гибридного дисгенеза [13]. Таким образом, у исследованных линий обнаружена различная реакция на облучение в малых дозах по частоте индукции РСПЛМ. По-видимому это связано с различиями в функциональных нарушениях, которое имеют мутанты mei-9 и mei-41. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли механизмов контроля клеточного цикла и репарации в определении генетических эффектов на действие облучения в малых дозах. ЛИТЕРАТУРА 1. Кузин А.М. О различии ведущих молекулярных механизмов при действии g-радиации на организм в больших и малых дозах // Изв. АН СССР. Сер. Биол., 1980. № 6. С. 883-890. 2. Сойфер В.Н. Репарация генетических повреждений // Сорос. образоват. журн., 1997. № 8. С. 4-13. 3. Beall E.L., Rio D.C. Drosophila P-element transposase is a novel site-specific endonuclease // Genes Dev., 1997. Vol. 11, № 16. P. 2137-2151. 4. Boyd J.B., Golino M.D., Setlow R.B. The mei-9a mutant of Drosophila melano-gaster increases mutagen sensitivity and decreases excision repair // Genetics, 1976. Vol. 84, № 3. P. 527-544. 5. Boyd J.B., Setlow R.B. Charac-terization of postreplication repair in mutagen-sensitive strains of Drosophila melanogaster // Genetics, 1976. Vol. 84, № 3. P. 507-526. 6. Breimer L.H. A DNA glycosylase for oxidized thymine residues in Drosophila melanogaster // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986. Vol. 134, № 1. P. 201-204. 7. Buendia P.G., de. Search for DNA repair pathways in Drosophila melano-gaster // Mutat. Res., 1998. Vol. 407, № 1. P. 67-84. 8. Ducaul J., Bregliano J., de La Roche Saint-Andre C. Gamma-irradiation stimulates homology-directed DNA double-strand break repair in Drosophila embryo // Mutat. Res., 2000. Vol. 460, № 1. P. 69-80. 9. Evidence for an inducible repair-re-combination system in the female germ line of Drosophila melanogaster. III. Corre-lation between reactivity levels, crossover frequency and repair efficiency / A. Lau-renзon, F. Gay, J. Ducau et al. // Genetics, 1997. Vol. 146, № 4. P. 1333-1344. 10. Finnegan D.J. Transposable elements: How non-LTR retrotransposons do it // Current Biol., 1997. Vol. 7, № 4. R245-R248. 11. Genetic analysis of X-linked mutagen-sensitive mutants of Drosophila melanogaster / J.M. Mason, M.M. Green, K.E. Shaw et al. // Mutat. Res., 1981. Vol. 81, № 3. P. 329-343. 12. Lindahl T., Saton M. S., Dianov G. Enzymes acting at strand interruptions in DNA // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B, 1995. Vol. 347, № 1319. P. 57-62. 13. Margulies L. A high level of hybrid dysgenesis in Drosophila: high thermo-sensitivity, dependence on DNA repair, and incomplete cytotype regulation // Mol. Gen. Genet., 1990. Vol. 220, № 3. P. 448-455. 14. Mutagen sensitivity and supres-sion of position-effect variegation result from mutations in mus209, the Drosophila gene encoding PCNA / D.S. Henderson, S.S. Banga, T.A. Grigliatti et al. // EMBO J., 1994. Vol. 13, № 6. P. 1450-1459. 15. O’Brochta D.A., Gomez S.P., Handler A.M. P-element excision in Drosophila melanogaster and related drosophilids // Mol. Gen. Genet., 1991. Vol. 225, № 3. P. 387-394. 16. O’Hare K., Rubin G. M. Structures of P transposable elements and their sites of insertion and excision in the Drosophila melanogaster genome // Cell, 1983. Vol. 34, № 1. P. 25-35. 17. Overexpression of a Rrp1 trans-gene reduces the somatic mutation and recombination frequency induced by oxi-dative DNA damage in Drosophila mela-nogaster / A. Szakmary, S.M. Huang, D.T Chang et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996. Vol. 93, № 4. P. 1607-1612. 18. Price A. The repair of ionising radiation-induced damage to DNA // Semin. Cancer. Biol., 1993. Vol. 4, № 2. P. 61-71. 19. Richardson C., Jasin M. Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks // Nature, 2000. Vol. 405, № 6787. P. 697-700. 20. Sander M., Lowenhaupt K., Rich A. Drosophila Rrp1 protein: an apurinic endonuclease with homologous recombi-nation activities // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991. Vol. 88, № 15. P. 6780-6784. 21. Sassone-Corsi P. Transcriptional checkpoints determining the fate of male germ cells // Cell, 1997. Vol. 88, № 2. P. 163-166. 22. Sekelsky J.J., Burtis K.C., Haw-ley R.S. Damage control: The pleiotropy of DNA repair genes in Drosophila mela-nogaster // Genetics, 1998. Vol. 148, № 4. P. 1587-1598. 23. Targeted cytoplasmic irradiation with alpha particles induces mutations in mammalian cells / L.J. Wu, G. Randers-Person, A. Xu et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1999. Vol. 96, № 9. P. 4959-4962. 24. Teng S.-C., Kim B., Gabriel A. Ret-rotransposon reversetranscriptase-medi-ated repair of chromosomal breacks // Na-ture, 1996. Vol. 383, № 6601. P. 641- 644. 25. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere / R.W. Le-vis, R. Ganesan, K. Houtchens et al. // Cell, 1993. Vol. 75, № 6. P. 1083-1093. 26. The Drosophila meiotic recombi-nation gene mei-9 encodes a homologue of the yeast excision repair protein Rad1 / J.J. Sekelsky, K.S. McKim, G. Chin et al. // Genetics, 1995. Vol. 141, № 2. P. 619-627. 27. The Drosophila melanogaster RAD54 homolog, DmRAD54, is involved in the repair of radiation damage and recombination / R. Kooistra, K. Vreeken, J.B.M. Zonneveld et al. // Mol. Cell. Biol., 1997. Vol. 17, № 10. P. 6097-6104. 28. The Drosophila ribosomal protein S3 contains a DNA deoxyribophospho-diesterase (dRpase) activity / M. Sandi-gursky, A. Yacoub, M.R. Kelley et al. // J. Biol. Chem., 1997. Vol. 272, № 28. P. 17480-17484. 29. The mei-41 gene of D. melano-gaster is a structural and functional ho-molog of the human ataxia telangiectasia gene / K.L. Hari, A. Santerre, J.J. Se-kelsky et al. // Cell, 1995. Vol. 82, № 5. P. 815-821. 30. Tsukamoto Y., Ikeda H. Double-strand break repair mediated by DNA end-joining // Genes Cells, 1998. Vol. 3, № 3. P. 135-144. 31. Yacoub A., Kelley M.R., Deutsch W.A. Drosophila ribosomal protein PO contains apurinic/apyrimidinic endonu-clease activity // Nucleic Acids Res., 1996. Vol. 24, № 21. P. 4298-4303. 32. Zdzienicka M.Z. Molecular pro-cesses and radiosensitivity // Strahlenter Onkol., 1997. Vol. 173, № 9. P. 457- 461.
Логотип -
Начало -
Общие
сведения -
Структура -
Научная деятельность 4346 посещений с 04.11.2002 |