СТАТЬИ
ЭКСТРАКЦИЯ КАК МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ: КРАТКИЙ ОБЗОР
к.х.н. Т. Ширшова
Научные интересы: биоорганическая химия, химия алкалоидов, липидов, сапонинов Экстракция – один из древней ших методов выделения биологически активных веществ (БАВ) из природных растительных источников и в настоящее время остается основным методом при получении БАВ. В научной лаборатории многообразие видов экстрагируемых органических веществ способствовало созданию и развитию большого разнообразия методов экстракции, которые применяют не только для выделения БАВ из растительного сырья, но и для разделения смеси веществ и очистки индивидуальных органических соединений от примесей. Одним из наиболее чувствительных методов разделения и определения чистоты небольших (миллиграммовых) количеств природных и синтетических органических соединений является противоточное распределение. Новые методы противоточной экстракции с большой разделительной способностью в настоящее время непосредственно связаны с развитием хроматографических методов: экстракция твердого вещества жидкостью – с адсорбционной хроматографией, экстракция жидкости жидкостью – с распределительной хроматографией. Очень часто между этими процессами нельзя провести четкой границы. Для некоторых видов экстракции исторически возникли названия, которые постоянно пополняются новыми, отражая специфику или нюансы конкретного метода экстракции. Наиболее часто применяют простые в исполнении и результативные методы: мацерация, дигерирование, перколяция, перфорация и экстрагирование. Метод мацерации заключается в том, что вещество в твердой фазе в измельченном растительном источнике экстрагируют многократно при нормальной температуре небольшими порциями растворителя. Дигерирование отличается от мацерации лишь тем, что экстракция проводится при нагревании. При использовании метода перколяции вещество в твердой фазе экстрагируют растворителем при нормальной температуре противоточным методом. Простое экстрагирование заключается в том, что вещество экстрагируют из раствора одной порцией растворителя. Если экстракция повторяется несколько раз, то это повторное и/или фракционное экстрагирование. Если вещество непрерывно экстрагируют растворителем из раствора, то такой метод носит название перфорация. При использовании противотока процесс называется противоточной перфорацией. Эффективность любого вида экстракции твердого вещества жидкостью зависит прежде всего от его растворимости и скорости перехода из одной фазы в другую. Растворимость можно изменить, подбирая соответствующий растворитель, в который переходит преимущественно требуемое вещество, а присутствующие загрязнения остаются в твердой фазе. Скорость перехода вещества из твердой фазы в раствор определяется, в основном, скоростью проникновения жидкости в твердую фазу, скоростью диффузии вещества в жидкости и скоростью удаления вещества с поверхности раздела фаз. В отличие от системы двух жидких фаз равновесие на границе твердой и жидкой фаз наступает очень медленно. Ускорить приближение к равновесному состоянию можно путем увеличения поверхности твердой фазы за счет измельчения образца или постоянной подачей свежего растворителя на границу фаз. Кроме того, можно ускорить достижение равновесия посредством простого перемешивания (при мацерации и дигерировании) или при помощи противотока (при перколяции). Мацерация представляет собой простейший в исполнении и техническом оснащении способ экстракции, когда твердую фазу размешивают с растворителем и отфильтровывают. Тщательное измельчение повышает степень экстрагирования твердого вещества. Эффективность процесса увеличивается также при применении избытка растворителя, постоянном перемешивании и при тщательном отделении экстракта от сырья. Повторная мацерация несколькими меньшими порциями свежего растворителя дает лучшее извлечение, чем мацерация в один прием всем количеством растворителя. При перколяции – противоточной экстракции – в научных лабораториях используют перколяторы и экстракторы. Наиболее часто применяют экстрактор Сокслета, при помощи которого можно проводить непрерывную экстракцию в течение нескольких суток. Для выделения БАВ из растительного сырья используют весь спектр методов экстракции. Как правило, первым этапом при предподготовке сырья к экстракции БАВ является удаление липидов. Чаще всего для этих целей используют нейтральные растворители, спирты и их смеси [4, 6]. Одновременно с липидами при обработке надземной части растения, богатой хлорофиллом, удаляют большую часть зеленых и желтых пигментов, что значительно облегчает дальнейшее выделение искомых соединений. Так, одна из схем выделения фитоэкдистероидов из рдестов (р. Potamogeton) в качестве начального этапа предусматривает обработку воздушно-сухого растительного сырья гексаном и/или хлороформом [8]. При выделении стероидных гликозидов из диоскореи (Dioscorea deltoidea и D. caucasica) сухие измельченные корневища обезжиривали диэтиловым эфиром в аппарате Сокслета, а лиофильно высушенные клетки культуры D. deltoidea обезжиривали перколяцией хлористым метиленом [1]. Освобождение от общих липидов подземных органов и соцветий луков (Allium nutans и A. cernuum) при выделении стероидного сапогенина диосгенина проводили также перколяцией хлороформом в аппарате Сокслета [2]. Однако, если липиды являются искомым объектом исследования, то для полноты их извлечения используют различные растворители или смеси растворителей: хлороформ, гексан, диэтиловый эфир, ацетон, спирты и их смеси. Известно, что многие липиды являются важнейшими биологическими эффекторами, регуляторами и медиаторами, участвующими практически во всех физиологических процессах. Поэтому внимание к липидам лекарственных и других полезных растений, их функциям и биологическим свойствам в последнее время растет. Выделение индивидуальных липидов из исходного материала обычно включает несколько этапов. Первым этапом является разрушение ткани путем измельчения сухого сырья, следующим – экстракция нейтральных липидов, затем экстракция суммы фосфо- и гликолипидов с последующим фракционированием и выделением чистых веществ. Полноту извлечения липидов обеспечивает максимальное размельчение материала. Полярные растворители, такие, как метанол и этанол, которые разрушают водородные связи и ослабляют электростатическое взаимодействие липидов с белками, наиболее эффективно экстрагируют липиды. Использование спиртов для экстракции фосфолипидов удобно и тем, что они дезактивируют большинство липолитических ферментов, которые в активной форме вызывают деградацию липидов [4, 6]. Длительность экстракции и полноту экстрагирования, а также способ и условия проведения экстракции определяют в каждом конкретном случае. На практике для выделения липидов чаще всего используют два основных рутинных метода экстракции, позволяющих количественно извлекать липиды практически всех классов из самой ткани и ее фракций. Наиболее распространенным является метод Фолча, согласно которому экстракцию проводят смесью хлороформ-метанол (2:1) из расчета 20 частей экстрагирующей смеси на одну часть ткани. Этот метод позволяет получить достаточно высокий выход нейтральных липидов, диацилглицерофосфолипидов и сфинголипидов. Лизофосфолипиды переходят в раствор лишь частично, а более полярные кислые липиды могут теряться при промывке экстракта растворами солей и водой. Однако при повторных экстракциях и ограничении промывок выход липидов можно повысить до количественного. Другой метод предложен Блайем и Дайером, когда экстракцию липидов осуществляют смесью хлороформ-метанол (1:1) из расчета две части смеси на одну часть ткани. Однако и в этом случае при промывке водой наиболее полярные кислые фосфолипиды и лизофосфолипиды переходят в водную фазу и теряются. В зависимости от химической природы липидов используют модифицированные методы извлечения. Заменив смесь хлороформ-метанол на смесь хлороформ-2 %-ный раствор уксусной кислоты в метаноле, можно повысить выход полярных липидов. Впоследствии для этих же целей была применена смесь хлороформ-метанол-1М соляная кислота (4:2:3). При экстракции нейтральных и общих липидов часто используют неполярные растворители, такие, как хлороформ, гексан, диэтиловый эфир. Естественно, что при этом теряется большое количество полярных липидов. При выделении нейтральных липидов из семян лекарственных растений, в том числе из "маральего корня" (Rhaponticum carthamoides), использовали гексан [3]. При этом был получен высокий выход (20 %) общих липидов (ОЛ), сравнимый с выходом растительных масел (подсолнечное, маковое). При экстракции ОЛ из семян R. carthamoides хлороформом был получен такой же высокий выход (20 % сухой массы семян) ОЛ [7]. После экстракции хлороформом из семян R. carthamoides, интродуцированного в Ботаническом саду Института биологии Коми НЦ УрО РАН, было выделено 11.9 % ОЛ. Модифицированная нами методика Фолча (хлороформ и смесь хлороформа с метанолом) позволила выделить 15.7 %. Для выделения ОЛ из каллусов R. carthamoides, серпухи венценосной (Serratula coronata) и живучки ползучей (Ajuga reptans) также использовали модифицированный метод Фолча, что позволило провести количественную экстракцию липидов [9]. Однако применение полярных растворителей при экстракции липидов способствует выделению и других классов биологически активных соединений. Так, при проявлении хроматограмм ОЛ каллусов в УФ-свете (хроматоскоп УФС-254) нами было обнаружено пятно соединения, соответствующее хроматографической области 20-гидроксиэкдизона, особенно интенсивное на хроматограмме каллусов S. coronata. Аналогичная картина была ранее отмечена для каллусов R. carthamoides [5]. Из водных растений р. Potamogeton, в которых впервые были обнаружены экдистероиды, липидные фракции были выделены нами последовательно экстракцией гексаном, а затем хлороформом [8]. Полученные гексановые и хлороформенные экстракты ОЛ пяти видов растений р. Potamogeton, произрастающих на территории Республики Коми, проявили поразительно высокую антимикробную активность, даже в концентрации 1 мкг/мл полностью подавляя рост таких тест-культур микроорганизмов, как Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Pr. morgani, Pr. rettgeri [8]. Таким образом, экстракция – один из самых древних технологических процессов, освоенных еще древнейшими нашими предками, и в наши дни является одним из самых распространенных и чаще других используемых методов выделения и очистки БАВ. ЛИТЕРАТУРА 1. Васильева И.С., Пасешничен- ко В.А., Гусева А.Р. Стероидные сапонины из корневищ диоскореи кавказской Dioscorea caucasica // Прикладная биохим. и микробиол., 1984. Т. 20, № 3. С. 404-406. 2. Диосгенин из Allium nutans и Allium cernuum / А.Ф. Азаркова, В.А. Стихин, О.А Черкасов и др. // Химия природных соединений, 1983. № 5. С. 653. 3. Липиды некоторых лекарственных растений / С.Д. Гусакова, Г.А. Степаненко, Д.Т. Асимбекова и др. // Раст. ресурсы, 1983. Т. 19, вып. 4. С. 444-445. 4. Препаративная биохимия липидов / Л.Д. Бергельсон, Э.В. Дятловицкая, Ю.Г. Молотковский и др. М.: Наука, 1981. 259 с. 5. Синтез экдистероидов в растениях и культурах клеток Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin / И.В. Орлова, А.М. Носов, В.Г. Лукша, В.В. Володин // Физиол. растений, 1994. Т. 41, № 6. С. 907-912. 6. Степанов А.Е., Краснопольс- кий Ю.М., Швец В.И. Физиологически активные липиды. М.: Наука, 1991. 135 с.
Логотип -
Начало -
Общие
сведения -
Структура -
Научная деятельность 6303 посещений с 05.08.2002 |