СТАТЬИ
МИКРОСКОПИЯ АГРЕГАТОВ ПОРФИРИНА,
ИМИТИРУЮЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МИКРООБЪЕКТЫ
к.х.н. А. Удальцов
Научные интересы: фотосинтетические модельные системы проф., д-р Г. Каупп
Научные интересы: визуализация и анализ субмикроскопических объектов Развитие новых видов микроскопии, таких, как атомно-силовая микроскопия (atomic force microscopy, AFM), которая основана на эффекте наномеханических систем, в частности, появлении силы между зондирующим наконечником и атомами поверхности изучаемой структуры значительно расширяют возможности исследования микроструктуры [4, 5]. Разрешающая способность AFM достаточно высока и составляет 1 нм, что позволяет изучать микроскопические объекты и их структуру в нанометровом диапазоне. Этот метод позволяет также исследовать объекты, такие как агрегаты порфирина, которые не стабильны в условиях вакуума, т.е. при использовании сканирующей электронной микроскопии. С помощью последней недавно были обнаружены агрегаты протонированного тетрафенилпорфина с размерами порядка нескольких микрон [11]. Данные агрегаты состоят только из порфирина и воды [12] и имеют скорее всего упорядоченную структуру, в которой согласно ИК-спектрам их тонких пленок вода находится в квазикристаллическом состоянии. Предполагается, что физическая организация структуры данных агрегатов имитирует взаимоотношения веществ и соединений в живых клетках на молекулярном уровне. В связи с этим исследование структурной организации таких супер-мультимолекулярных ансамблей представляется нам очень перспективным направлением. Известно, что живые организмы, в частности, животные и растительные клетки более чем на 90 % состоят из воды. Столь высокий процент воды необходим не только как среда для осуществления биохимических реакций, но прежде всего как организующий фактор структуры «живого вещества». Исследование биохимических реакций и свойств участвующих в них веществ проводят в течение многих десятилетий, что позволило получить обширные знания о сложных процессах в живых организмах [3]. Напротив, хотя свойства жидкой воды также тщательно исследовали не одно десятилетие [6], тем не менее роль воды в "живом веществе" освещают слабо или просто игнорируют. Следует отметить, что вода как организующий фактор "живого вещества", вообще говоря, не вписывается ни в одну из существующих современных теорий. Имеются многочисленные работы, посвященные состоянию воды в полимерах и биополимерах [1], тогда как роль воды в организации структуры надмолекулярных систем была предметом изучения лишь в некоторых публикациях [13]. Настоящая работа посвящена исследованию образования структуры водно-органической матрицы, а именно структуры, состоящей из воды и порфирина, имитирующей процессы организации "живого вещества". В данной работе были исследованы структурированные агрегаты протонированного мезо-тетрафенилпорфина с помощью абсорбционной спектроскопии и атомно-силовой микроскопии. Синтез мезо-тетрафенилпорфина (ТФП) проводили в соответствии с методиками, описанными ранее [8]. Тетрагидрофуран (ТГФ) и другие органические растворители перед использованием дополнительно очищали по общепринятым методикам. Условия приготовления крупномасштабных агрегатов протонированного ТФП с размерами порядка нескольких микрон в растворе в присутствии 0.4 N HCl и приготовление тонких пленок агрегатов данного порфирина описаны в другой работе [11]. Агрегаты этого типа получали аналогичным образом также в присутствии 0.8 N и 6 % HCl. Приготовление агрегатов порфирина второго типа в растворе вода:ТГФ (97:3, v/v) проводили в присутствии 6 % HCl при интенсивном встряхивании раствора до появления пены. После исчезновения пены в растворе наблюдали очень мелкие взвешенные частицы зеленого цвета. Для регистрации спектров поглощения использовали спектрофотометр Perkin-Elmer Lambda 15. Перед измерением спектров растворы порфирина, содержащие агрегаты, взбалтывали. Микрографическое изображение агрегатов порфирина в тонких пленках получали с использованием атомно-силовой микроскопии с помощью Rasterscope 4000 (DME) или контактной атомно-силовой микроскопии с помощью Nanoscope II (Digital Instruments Inc.). Для исследования поверхности агрегатов применяли консоль с наконечником из стекловолокна с радиусом острия 20 нм [9], который получали с помощью прибора P-2000 Quartz Micropipette Puller или V-образную консоль с длиной 200 mм и наконечником из Si3N4. Изображение поверхности агрегатов порфирина записывали в режиме высоты с постоянной силой. После смешивания растворов порфирина и соляной кислоты агрегаты порфирина в растворе визуально не наблюдали, но раствор обычно сильно опалесцировал. В зависимости от концентрации порфирина спустя некоторое время в растворе появлялся легкий осадок зеленого цвета, который однако растворялся при перемешивании. Спектры поглощения агрегатов протонированного ТФП двух разных типов, полученных в различных условиях, существенно отличаются (рис. 1). Агрегаты первого типа (кривая 1) содержат в основном моно-протонированные димеры ТФП с lmax = 403 нм и 465 нм, которые, как предполагается, отличаются cis- и trans-конфигурациями протонированного макроцикла в составе димера [11]. Данные агрегаты также содержат ди-протонированный димер ТФП с lmax = 437 нм, но в очень малой концентрации. В красной области спектра полосы соответствующих димерных форм сильно перекрываются, образуя одну широкую полосу с максимумом при 698 нм. Другой тип агрегатов (кривая 2) содержит преимущественно ди-протонированные димерные формы, максимумы которых в области полосы Соре сливаются, образуя одну широкую полосу при 421 нм, а также содержит моно-протонированные димеры ТФП в небольших концентрациях. В красной области спектра раствора данных агрегатов наблюдали широкую полосу с lmax = 671 нм, положение максимума которой характерно для ди-протонированного состояния димеров ТФП. Таким образом, агрегаты разного типа отличаются друг от друга по составу в них различных протонированных димерных форм. Агрегаты первого типа являются наиболее устойчивыми и были обнаружены при разных условиях их приготовления. Агрегаты, полученные в присутствии 6 %-ной HCl, видны на поверхности тонкой пленки как 3-5 mм домены (рис. 2). Хотя агрегаты этого типа, приготовленные в присутствии 0.4 N HCl, ранее наблюдали расположенными отдельно друг от друга, а морфология агрегатов в значительной степени зависела от природы органического компонента [11]. При использовании контактной атомно-силовой микроскопии, на поверхности агрегатов этого типа обнаружена тонкая структура, которая состоит из слипшихся сферических частиц размером 200-400 нм (рис. 3). Профили данной микроструктуры (рис. 4) демонстрируют ее своеобразие, а именно, сферические наночастицы слипаются в беспорядке, формируя на поверхности бугры и впадины. Таким образом, поверхность агрегатов первого типа образуется при слипании сферических частиц, которые содержат димерные протонированные формы ТФП и значительное количество воды [12]. При получении агрегатов второго типа интенсивное встряхивание раствора приводит к разрушению крупных агрегатов и дальнейшему протонированию моно-протонированных димеров ТФП с образованием ди-протонированных димерных форм. В результате этих процессов поглощение в области полосы Соре сильно возрастает, а в растворе в преобладающем количестве оказываются ди-протонированные димеры ТФП. В тонких пленках, полученных с использованием таких растворов, обнаруживали с помощью контактного AFM совершенно другую картину агрегатов, которая похожа на изображение отростков нервных клеток – дендритов (рис. 5). Наряду с отростко-образными объектами с диаметром 100-400 нм на рисунке также видны сферические частицы диаметром 200-400 нм. Профили поверхности (рис. 6), где встречаются отдельные сферические частицы и наложенные друг на друга отростки, формирующие дендритоподобную картину, показывают примерно в два раза большие изменения рельефа по высоте (рис. 4). Следовательно, с увеличением заряда на димерах порфирина появляется избыточный суммарный заряд, который препятствует образованию крупных объемных объектов, в результате чего слипание сферических частиц осуществляется лишь в одном направлении, хотя часть из них остается в отдельном (не слипшемся) состоянии. Таким образом, результаты показывают, что два разных типа микрообъектов образуются из сферических частиц с размерами 200-400 нм. Морфология данных микрообъектов зависит от их состава, т.е. содержания различных димерных форм протонированного ТФП. Наличие ди-протонированных димеров в агрегатах приводит к тому, что их структура приобретает избыточный заряд, который препятствует образованию крупных объемных объектов. В этом случае самосборка осуществляется фактически в одном направлении и дает в результате отросткоподобные агрегаты, похожие на дендриты нервных клеток. Полученные результаты предполагают, что в нормально функционирующих биологических клетках каждая молекула находится под влиянием сил дальнодействия, благодаря которым макромолекулы и соединения, наполняющие клетку, организованы как "живое вещество". Отсюда, данные организованные микрообъекты двух разных типов имитируют молекулярно-структурную организацию биологических микрообъектов, а именно, клеток растений и нервных клеток животных. В связи с этим, прежде всего нас интересует вопрос, что является организующим фактором веществ и соединений, наполняющих клетку организма. Оболочка или клеточная мембрана не несет такой функции, поскольку молекулы и макромолекулы внутри ее должны представлять собой не просто смесь, а качественно иное состояние, состояние "«живого вещества". Представленные выше результаты показывают, как различный состав димеров порфирина и их заряд определяет форму микрообъекта, состоящего из порфирина и воды. В зависимости от состава и заряда, локализованного на димерах ТФП, образуются различные агрегаты, домены с размерами 2-3 mм ґ 3-5 mм или длинные цилиндроподобные структуры, похожие на отростки нервных клеток. Диаметр данных цилиндроподобных агрегатов в значительной степени варьирует и находится в основном в пределах 100-400 нм. Их длина составляет несколько микрон и доходит до 10 mм и более. Таким образом, форма данных микрообъектов зависит от внутренней организации водно-органической матрицы, т.е. структуры, состоящей из воды и порфирина, а также от взаимодействий в водно-порфириновой структуре, которые распространяются на достаточно большие расстояния, сравнимые с размерами клеток растений или нервных клеток животных. Следовательно, ответ на поставленный выше вопрос мы должны искать в свойствах внутренней среды. Структурной единицей растительного или животного организма является клетка, которая представляет собой единое целое, выполняет определенную функцию и поддерживает свою структуру постоянной. Осуществление этих функций «живого вещества» возможно благодаря нуклеиновым кислотам, в частности ДНК, на которой активируются или репрессируются определенные гены. Однако на молекулярном уровне "жизнь" клетки состоит из отдельных актов взаимодействия макромолекул между собой или с другими соединениями, актов узнавания и т.д., которые осуществляются через среду, т.е. структуру жидкой воды. Следовательно именно жидкое состояние воды организует «живое вещество» на молекулярном уровне. Как это происходит и в чем состоит предлагаемая гипотеза? Предполагают, что физической основой формирования в воде кластеров с кооперативными свойствами являются коллективные осцилляции молекул воды, когда каждая из молекул периодически поворачивается на 180°. Такое периодическое движение, распространяющееся во все стороны, генерирует осцилляции дипольного момента молекул воды. В результате в структуре воды в области с синхронной переориентацией ее молекул формируется кластер. Мы не считаем, что это должны быть "мерцающие кластеры" с льдоподобной структурой, предложенные Франком и Веном [7], или какие-либо кластеры, идентифицируемые по структурному признаку. Скорее всего это должны быть кластеры, которые выделяются по сходным коллективным движениям, благодаря чему структура жидкой воды приобретает кооперативность. Существование кластеров, т.е. некоторым образом упорядоченных структур, состоящих из молекул воды, в настоящее время не подвергается сомнению. Однако динамические кластеры, т.е. кластеры, порождаемые сходным типом движения в структуре жидкой воды привлекали внимание лишь эпизодически. Одной из таких моделей кластеров воды является гипотеза о переносах протонов, когда поворот одной из молекул на 180° в структуре сетки водородных связей приводит к переориентации соседних молекул и осуществляется периодически. Частота данных колебаний составляет – 1000 см–1 для протонных переносов и 800 см–1 для переноса дейтрона [2]. Частоты, очень близкие к первой, были обнаружены в водных растворах различных димерных форм протонированного ТФП методом резонансного квази-упругого рассеяния света [10]. Следовательно, предлагаемая здесь гипотеза и интерпретация результатов находится в хорошем согласии с данными, полученными ранее другим методом. В водно-порфириновой структуре, где димеры протонированного ТФП содержат водную оболочку и имеют упорядоченное расположение, формируется своего рода водно-порфириновая матрица, содержащая протоны. Благодаря вовлечению воды в структуру водно-порфиринового димерного комплекса [12] положительные заряды могут делокализоваться по структуре водородных связей водной оболочки, окружающей димеры ТФП. В результате частичный заряд на атомах водорода молекул воды увеличивается, а синхронные осцилляции зарядов приводят к формированию кластеров существенно большего размера, чем в структуре жидкой воды. Действительно, сферические водно-порфириновые частицы размером 200-400 нм (рис. 3) представляют собой как раз такие кластеры, в которых расположение димеров протонированного ТФП должно быть упорядоченным. Данные сферические наночастицы могут слипаться с образованием приведенных выше микрообъектов двух типов (рис. 2 и 5). Механизм слипания микрочастиц в водной среде был предложен для мельчайших частиц глины Уоттерсоном и разработана кластеро-волновая модель жидкой воды [13, 14]. Основные положения этой модели объясняют кооперативность поведения биологических суперструктур, однако физическая основа кооперативности пока остается в тени. Мы полагаем, что результаты, приведенные в данной статье, существенно дополняют базис для дальнейшей разработки кластеро-волновой модели и освещения свойств жидкой воды, еще не нашедших разумного объяснения. Таким образом, результаты, приведенные в данной работе, показывают, что структура микрообъекта определяется свойствами его внутренней среды, в которой специфика взаимодействия между молекулами может передаваться на достаточно большие расстояния внутри данного микрообъекта. Такая передача возможна благодаря пространственной сетке водородных связей жидкой воды, как внутренней основы. С этой точки зрения мы полагаем, что структура жидкой воды организует ""живое вещество", т.е. фактически оживляет те макромолекулы и соединения, которые наполняют клетки организма. Другими словами, структура жидкой воды является внутренней средой, в которой кооперативность взаимодействия между молекулами может передаваться на достаточно большие расстояния порядка нескольких микрон. Предполагается, что физической основой дальнодействия кооперативности структуры жидкой воды является периодическая переориентация молекул воды, которая распространяется в виде волны во все стороны в пределах кластера. В живых организмах такими кластерами фактически являются их клетки, функционирующие как единое целое благодаря волнам переполяризации молекул, составляющих водно-органический матрикс клеток. Фактически, волны кооперативного взаимодействия в жидкой воде организуют структуру микрообъекта как единую водно-органическую матрицу, где каждая молекула подвергается действию осцилляций воды. Данная работа выполнена при финансовой поддержке Германской службы академических обменов, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Ref. 325, Kennziffer: A/01/06685. ЛИТЕРАТУРА 1. Вода в полимерах / Под ред. С. Роуленд. М.: Мир, 1984. 555 с. 2. Зацепина Г.Н. Физические свойства и структура воды. М.: Изд-во МГУ, 1987. 170 с. 3. Ленинджер A. Биохимия / Под ред. А.А. Баева и Я.М. Варшавского. М.: Мир, 1974. 956 c. 4. AFM for the imaging of large and steep submicroscopic features, artifacts and scraping with asymmetric cantilever tip / G. Kaupp, J. Schmeyers, U. Pogodda et al. // Thin solid films, 1995. Vol. 264. P. 205-211. 5. Design of functionalized lipids and evidence for their binding to photosystem II core complex by oxygen evolution measurements, atomic forced microscopy, and scanning near-field optical microscopy / E. Trudel, J. Gallant, S. Mons et al. // Can. Biophys. J., 2001. Vol. 81. P. 563-571. 6. Eisenberg D., Kauzmann W. The structure and properties of water. Oxford: Oxford Univ. Press, 1969. 282 p. 7. Frank H.S., Wen W.Y. Structure formation in liquid water // Discussions Faraday Soc., 1957. Vol. 24. P. 133-144. 8. Fuhrhop J.-H., Smith K.M. Laboratory methods // Porphyrins and metalloporphyrins / Ed. K.M. Smith. Amsterdam: Elsevier, 1975. 869 p. 9. Kaupp G., Herrmann A., Wagenblast G. Scanning near-field optical microscopy (SNOM) with uncoated tips – applications in fluorescence techniques and Raman spectroscopy // Proc. of the SPIE, 1999. Vol. 3607. P. 16-25. – (electronic version at http:// kaupp.chemie.uni-oldenburg.de) 10. Udal’tsov A.V., Churin A.A. Molecular complexes between dimeric forms of porphyrin and water and their vibrational dynamics // Internet Photochem. and Photobiol., 1998. – (http://www.photobiology.com/IUPAC98/Udaltsov/index.htm) 11. Udal’tsov A.V., Kazarin L.A., Sweshnikov A.A. Self-assembly of large-scale aggregates of porphyrin from its dimers and their absorption and luminescence properties // J. Mol. Struct., 2001. Vol. 562. P. 227-239. 12. Water-porphyrin interactions and their influence on self-assembly of large-scale porphyrin aggregates / A.V. Udal’tsov, L.A. Kazarin, V.A. Sinani et al. // J. Photochem. Photobiol. A: Chem., submitted. 13. Watterson J.G. A role for water in cell structure // Biochem. J., 1987. Vol. 248. P. 615-617. 14. Watterson J.G. Wave model of liquid structure in clay hydration // Clays & Clay Miner., 1989. P. 285-286. v
Логотип -
Начало -
Общие
сведения -
Структура -
Научная деятельность 4221 посещений с 28.06.2002 |