В. Филиппова Научные интересы: высшие растения, культуры клеток, вторичный метаболизм, экдистероиды
Растительный мир является огромным природным производителем разнообразных классов химических соединений и важнейшим источником получения лекарственных препаратов различной направленности действия. Однако естественные растительные ресурсы многих видов ограничены, что делает актуальным поиск альтернативных источников сырья. В настоящее время одним из перспективных сырьевых источников является культура клеток высших растений. Интерес к культуре in vitro обусловлен и тем, что пассируемые клетки растений являются удобными модельными системами для изучения ростовых и метаболических процессов, происходящих в клетках, выведенных из-под контроля организма. Специфика этих моделей заключается в том, что при этом они сохраняют ряд свойств, характерных для исходного организма. И одним из таких свойств является способность к синтезу вторичных метаболитов. Исследуемые нами культуры клеток растений серпухи венценосной (Serratula coronata L.) и живучки ползучей (Ajuga reptans L.) накапливают в качестве вторичных метаболитов фитоэкдистероиды, высокая биологическая активность которых давно привлекает интерес исследователей. Изучение культур клеток экдистероидсодержащих растений разного систематического положения имеет важное теоретическое значение для понимания физиолого-биохимических закономерностей существования их как самостоятельных биологических систем. Имеющиеся в настоящее время данные о закономерностях биосинтеза экдистероидов в культурах растительных клеток немногочисленны. В большинстве случаев они свидетельствуют о невысоком уровне синтеза экдистероидов в культурах in vitro, содержащих этот метаболит. В связи с этим нами было предпринято изучение изменения качественного и количественного состава экдистероидов при длительном культивировании в системе in vitro. На первом этапе работы нами были исследованы ростовые и биосинтетические параметры длительно культивируемых каллусных культур. Для исследуемых штаммов в линейной системе координат была получена S-образная кривая роста по сырой и сухой массе (рис. 1, 2). Полученные данные (см. табл.) позволяют утверждать, что исследованные штаммы обладают в целом относительно невысокой удельной скоростью роста. Средние значения митотических индексов в цикле роста, наоборот, свидетельствуют о довольно высокой пролиферативной активности каллусных культур. За четырехлетний период культивирования в условиях in vitro индексы роста по сырой и сухой биомассе возросли в 1.2-3.0 раза, что связано с отбором клеток по максимальной и/или устойчивой пролиферации [4]. Продолжительный рост в системе in vitro вызвал изменение качественного и количественного состава экдистероидов. В каллусных культурах обоих видов возрастает содержание 20-гидроксиэкдизона (20Е). Прекращается синтез метаболитов, характерных для молодых каллусных культур. Экдистероидный профиль каллусной культуры S. coronata становится практически полностью идентичным интактному растению, а в культуре клеток A. reptans присутствуют четыре из семи идентифицированных в растении экдистероидов. Изучение синтеза экдистероидов в динамике роста показало, что в культуре ткани S. coronata максимум содержания 20Е приходится на начало экспоненциальной фазы роста. Содержание инокостерона в этой культуре держится практически на одном уровне в течение всего пассажа (0.06±0.005 %) (рис. 1). В каллусах A. reptans пик синтеза 20Е приходится на середину экспоненциальной фазы роста (рис. 2). Следующим этапом работы было проведение аналогичных исследований для суспензионных культур этих видов растений. Переход в нашем случае к периодическому культивированию (суспензионным культурам) в первую очередь был вызван тем, что при таком режиме культивирования, как правило, происходит интенсификация ростовых процессов, а в ряде случаев [3, 5] увеличивается биосинтетический потенциал культур. Основным критерием при выборе исходного материала для получения суспензионных культур была наибольшая способность каллусов к синтезу 20Е. В десятом пассаже были получены хорошо растущие суспензионные культуры. При культивировании в виде суспензий в течение двух лет с циклом выращивания 12-14 дней в стандартных условиях штаммы имели стабильные показатели по всем анализируемым признакам. Рост обеих культур описывается типичной для клеточных суспензий S-образной кривой (рис 3, 4). На ней можно выделить lag-период (2-3 суток) и период экспоненциального роста (7-9 суток), когда клетки интенсивно делятся. К концу этой фазы их число для обеих культур увеличивается в восемь раз. Стационарная фаза (3-5 суток) сменяется фазой деградации. Переход к суспензионным культурам способствует интенсификации ростовых процессов, что соответственно вызывает повышение удельных скоростей роста по сравнению с каллусами. Суспензионные культуры обладают относительно высокими значениями митотической активности и удельных скоростей роста по всем исследуемым параметрам (см. табл.). Подсчет числа живых и мертвых клеток суспензионной культуры A. reptans показывает, что культура на протяжении всего пассажа характеризуется высокой жизнеспособностью (89.44±1.69 %), некротические процессы незначительны и сохраняются на одном уровне в течение всего пассажа. Культура клеток S. coronata характеризуется более низкой жизнеспособностью (75.44±8.77 %) и большей вариабельностью этого параметра в течение цикла культивирования по сравнению с суспензионной культурой A. reptans. Исследование качественного состава экдистероидов в культурах клеток серпухи венценосной и живучки ползучей показало, что дедифференцированные клетки сохраняли способность к синтезу экдистероидов, типичных для целого растения in vivo (20Е, инокостерон, макистерон А и экдизон для S. coronata и 20E, полиподин В, 29-норсенгостерон и аюгалактон для A. reptans). Смена типа культивирования не влияет на качественный состав экдистероидов. Также как и в случае длительно культивируемых каллусных культур, экдистероидный профиль суспензионных культур приближен к спектру интактного растения. Изучение динамики накопления 20Е в суспензионных культурах S. coronata и A. reptans показало, что в этом случае наблюдается отклонение от известной закономерности накопления вторичных метаболитов в цикле выращивания культуры клеток растений. Как правило, усиление синтеза вторичных метаболитов в условиях in vitro наблюдается в конце цикла выращивания при замедлении или остановке клеточной пролиферации. Как частный случай этой ситуации, можно отметить накопление продуктов вторичного метаболизма в клетках на стационарной фазе ростовой кривой. Считают, что это связано с разобщенностью во времени процессов первичного и вторичного метаболизма. Содержание экдистероидов в биомассе исследованных нами суспензионных культур значительно колеблется в течение одного цикла выращивания (рис. 3, 4). Колебательный характер накопления вторичных метаболитов – явление довольно редкое в культурах растительных клеток. Волнообразный характер накопительных кривых был описан ранее для каллусной культуры женьшеня – продуцента гинзенозидов [2] и для культур клеток Arnebia euchroma – продуцента шиконина [6]. Для подтверждения предположения о распаде гинзенозидов на определенных этапах роста было определенно содержание гликозидаз, которые не только гидролизуют гликозидную связь, но и обладают способностью катализировать реакцию трансгликозилирования. Было обнаружено, что динамика активности гликозидаз в клетках женьшеня обнаруживает обратную связь с содержанием в них гинзенозидов и также носит колебательный характер. Волнообразный характер накопления экдистероидов в течение одного цикла выращивания, обнаруженный нами, не был ранее описан для культур клеток растений – продуцентов экдистероидов. Имеются данные о динамике накопления неидентифицированного экдистероида в цикле культивирования суспензионной культуры Rhaponticum carthamoides Willd. (Iljin) [5]. Максимальное содержание этого метаболита отмечено в начале экспоненциальной фазы, затем происходило постепенное снижение содержания в течение пассажа. Есть сведения о накоплении экдистероидов в суспензионной культуре Pteridium aqvilinum [7], которое также, как и рост, имело поступательный характер и изменялось в конце периода субкультивирования за счет активной диффузии метаболитов в питательную среду. В конце цикла выращивания накопительные кривые 20Е и понастерона выходили на плато, а содержание экдизона продолжало увеличиваться, что объясняли различной растворимостью этих соединений. В нашем случае колебательный характер накопительных кривых также может быть объяснен двумя причинами: протеканием поочередно или одновременно процессов синтеза и распада этих веществ в клетках, или периодическим выделением экдистероидов из клеток в питательную среду. В связи с этим мы проанализировали содержание экдистероидов в пробах питательной среды. Полученные результаты показали, что на протяжении всего цикла роста эти соединения в среду не выделяются. Следовательно, на определенных этапах ростового цикла экдистероиды в клетках подвергаются распаду. Механизм накопления и распада экдистероидов в культуре клеток представляет большой интерес как с теоретической, так и с практической точек зрения и составляет предмет наших дальнейших исследований. Таким образом, по данным литературы и результатам наших исследований можно сделать вывод об отсутствии связи образования экдистероидов с какой-либо определенной фазой роста. Вероятно характер накопления экдистероидов, обнаруженный нами в суспензионных культурах S. coronata и A. reptans, является специфичным для данных штаммов. Как правило, закономерности синтеза вторичных соединений в культуре in vitro отличаются от таковых в интактных растениях, и установленные закономерности этого процесса в культуре клеток противоречивы [4]. Стабильность синтеза вторичных соединений неодинакова для разных классов соединений и для разных клеточных культур. Часто для культивируемых клеток растений характерно изменение спектра синтезируемых соединений вторичного обмена по сравнению с интактным растением. Иногда спектр расширяется, появляются вещества, не обнаруженные в интактных растениях. Наличие нехарактерных для целого растения неидентифицированных метаболитов было обнаружено в молодых каллусных культурах S. coronata и A. reptans [1]. Однако в исследованных нами культурах клеток при длительном культивировании синтез нетипичных для интактного растения и характерных для молодых каллусных культур неидентифицированных метаболитов прекращается. Таким образом, экдистероидный профиль в культурах in vitro становится сходным с таковым в интактном растении. В случае S. coronata спектр экдистероидов аналогичен спектру в интактном растении, за исключением одного неидентифицированного метаболита. Экдистероиды в культуре клеток A. reptans представлены не так полно, как в интактном растении. Сравнительное изучение содержания экдистероидов в каллусных и суспензионных культурах показало, что в нашем случае наблюдается снижение уровня содержания экдистероидов в 1.5-1.7 раза при переходе к периодическому культивированию. Однако здесь следует отметить, что максимум содержания 20Е в каллусных культурах приходится на начало-середину экспоненциальной фазы, когда прирост биомассы еще невелик, а в суспензионных культурах максимум синтеза приходится на конец экспоненциальной – начало стационарной фазы. К тому же при периодическом культивировании происходит увеличение удельной скорости роста и сокращение периода субкультивирования. Полагаем, что использование суспензий в биотехнологических целях более перспективно и экономически выгодно по сравнению с каллусными. Полученные суспензионные культуры S. coronata и A. reptans являются высокопродуктивными клеточными линиями. Содержание 20Е в суспензионной культуре S. coronata всего лишь в 2-3 раза ниже концентрации этого метаболита в интактном растении. Для культуры A. reptans этот показатель превышает интактное растение в 4-8 раз. Таким образом, в результате проведенных исследований получены сведения о составе, содержании и закономерностях синтеза экдистероидов, необходимые для практического использования культур клеток S. coronata и A. reptans. Полученные суспензионные культуры S. coronata и A. reptans, являющиеся хорошо адаптированными клеточными популяциями, могут быть предложены в качестве перспективных источников биотехнологического получения ценных биологически активных соединений – экдистероидов. ЛИТЕРАТУРА 1. Ануфриева Э.Н. Ростовые и биосинтетические характеристики культур клеток Serratula coronata и Ajuga reptans – продуцентов экдистероидов: Автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 1997. 26 с. 2. Исследование динамики биосинтеза гинзенозидов в цикле роста каллусной культуры клеток женьшеня / Н.А. Константинова, В.В. Маханьков, Н.И. Уварова и др. // Биотехнология, 1995. № 9-10. С. 35-39. 3. Культура изолированных клеток и тканей серпухи венценосной как источник биологически активных фитоэкдистероидов / М.Л. Саад, П.Г. Коваленко, Т.В. Медведева и др. // Физиология и биохимия культурных растений, 1992. Т. 24, № 6. С. 611-615. 4. Носов А.М. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиол. растений, 1994. Т. 41, № 6. С. 873-878. 5. Орлова И.В. Регуляция процессов роста и биосинтеза экдистероидов в культуре клеток левзеи сафлоровидной: Автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 1993. 24 с. 6. Пороник О.А., Кунах В.А., Адонин В.И. Накопление шиконина и цитологические особенности высокопродуктивного клеточного штамма Arnebia euchroma при поверхностном и глубинном культивировании // Биополимеры и клетка, 1999. Т. 15, №. 6. С. 501-509. 7. Svatos A., Macek T. The rate production in suspension cultured cells of the fern Pteridium aquilinum // Phytochem., 1994. Vol. 35, № 3. P. 651-564.
Логотип -
Начало -
Общие
сведения -
Структура -
Научная деятельность 3547 посещений с 10.10.2001 |