к.х.н. Н. Политова,
с.н.с. лаборатории биохимии и биотехнологии растений
к.х.н. Е. Пшунетлева,
н.с. лаборатории биохимии и биотехнологии растений Экдистероиды, представляющие собой полигидроксилированные стероиды, привлекают интерес исследователей благодаря своей высокой биологической активности. Как известно, у членистоногих они регулируют процессы линьки и метаморфоза [8]. Физиологическое действие экдистероидов на млекопитающих обусловлено их свойством стимулировать биосинтез белка при отсутствии побочного гормонального эффекта. Показана перспектива их использования в составе лекарственных препаратов адаптогенного, кардиотропного, противоязвенного и ранозаживляющего действия [10]. Кроме свободных экдистероидов из различных природных источников выделены их производные, в том числе сложные эфиры с высшими жирными кислотами. Они являются неактивными резервными формами гормона линьки насекомых и запасаются в органеллах яйцеклеток взрослых самок. Показано, что образование ацильных производных обратимо, и в процессе эмбриогенеза под действием внутриклеточных эстераз происходит высвобождение активной формы гормона [8]. Использование принципа обратимого конъюгирования экдистероидов, реализуемого в организме насекомых, представляется нам перспективным направлением для создания экдистероидсодержащих ранозаживляющих препаратов пролонгированного действия. Путем введения в состав молекул экдистероидов гидрофобных блоков, как в случае модификации высшими жирными кислотами, диглицеридами или иммобилизации на полимерной матрице, возможно получение производных с амфифильными свойствами. Такие препараты будут обладать возможностью дозированного высвобождения лекарственного начала, эффективного проникновения его в клетки-мишени и могут быть использованы как в свободном, так и в инкапсулированном виде (например, липосомальные формы). По-видимому, так же, как и в случае природного конъюгата с высшими жирными кислотами, гидрофобный фрагмент придает способность молекуле экдистероида к включению в липидный бислой. Взаимодействие экдистероида с гидрофобным фрагментом посредством сложноэфирной связи позволяет получить лабильные конъюгаты, легко разрушающиеся гидролитическими ферментами, что было установлено нами экспериментально [2]. Синтетические производные экдистероидов также могут быть использованы в качестве стандартов в биохимических исследованиях по определению их роли в природных объектах. Как показали исследования, содержание производных экдистероидов в природных объектах мало. Их выделение является трудоемким процессом, поэтому для их получения целесообразно использование методов химической трансформации доступных экдистероидов из растений. Содержание фитоэкдистероидов в некоторых видах растений довольно высоко и может составлять до 1-2 % на сухую массу, что на несколько порядков превышает содержание зооэкдистероидов в беспозвоночных (десятки нг/г массы насекомых, в пересчете на сухую массу – 10-6 %). Следовательно, растения представляют собой доступный источник необходимых количеств чистых гормонов для научных исследований. Создание эффективных лекарственных препаратов возможно при последовательном изучении связи между строением органических соединений и их биологическими функциями. Было установлено, что для проявления активности гормона линьки (molting hormone; далее – MH-активности) необходимо наличие в структуре молекулы экдистероида функциональных групп в определенных конфигурациях и положениях. Отсутствие или модификация гидроксильной группы в положении 22 экдистероидного скелета вызывает уменьшение гормональной активности в 20 раз, а изменение ее конфигурации приводит к исчезновению MH-активности, как в случае 22-изоэкдизона и 22-изоэкдистерона. Гидроксильные группы в положениях 20 и 25 не влияют на гормональную активность; укорочение или отсутствие боковой цепи (рубростерон, постстерон) приводит к полному исчезновению МН-активности. Защита 2b-оксигруппы в виде сложного эфира не вызывает заметного снижения активности, в то время как 3b-оксигруппы – значительно снижает ее. Ди-, три- и тетрапроизводные карбоновых кислот являются неактивными [1]. По своему химическому строению экдистероиды представляют собой стероидные гормоны, в структуру которых входят четыре сконденсированных кольцевых ядра и боковая цепь, как у холестерина (рис. 1). Характерной особенностью 20Е является наличие шести гидроксильных групп: трех вторичных (при С2, С3 и С22) и трех менее реакционноспособных третичных (при С14, С20 и С25), за счет которых и возможны различные химические превращения. Изучение реакций химической трансформации 20Е позволило выяснить реакционные способности гидроксогрупп и расположить их по уменьшению в следующий ряд: 2,3,22>25>20>>14, что подтверждает трудность получения индивидуальных монопроизводных 20Е. Продуктами непосредственной химической трансформации 20Е и Е являются моно-, ди-, три- и тетрапроизводные, а также их смеси. Синтез монозамещенных продуктов проводят при использовании эффективных способов защиты диольных групп. Например, для инактивации диольной группировки при С20, С22 при синтезе гликозидов 20Е использовали фенилборную кислоту, ацетатные группы были выбраны для защиты гидроксилов при С2, С3, С22 и С25 [9]. Для введения гликозидных заместителей был использован тетра-О-ацетилглюкопиранозил бромид на силикате серебра, все реакции проводились в инертной атмосфере. Полученные гликозиды были отделены от реакционной смеси методом нормально-фазовой ВЭЖХ. Выходы продуктов составили 40-70 %, их пространственное строение было установлено с помощью 1ЯМР-спектроскопии. Для получения 25-гликозида 20E была проведена предварительная ацетатная защита гидроксильных групп по положениям 2-, 3- и 22-. Выход продукта после гликозилирования и гидролиза защитных групп составил 69 %. При синтезе 3-гликозидов те же авторы использовали сочетание защиты диольной группы в положении 20,22- в виде фенилборатного производного и ОН-группы в положении 2- – в виде ацетата. При гликозилировании образовавшихся соединений была получена смесь 3- и 25-гликозидов в отношении 1:1. При непосредственном действии на 20,22-фенилборат 20E гликозирующим агентом были получены 2-, 3- и 25-гликозиды 20E с выходами 42, 21 и 7 % соответственно. Приведенные данные свидетельствуют, что фенилборная кислота является удобным реагентом для защиты диольной группы 20Е в положении 20,22-, поскольку может быть введена строго селективно, а ее удаление протекает в мягких условиях с количественным выходом. Для синтеза различных сульфатных эфиров Е в качестве сульфирующего агента был использован комплекс триэтиламинсульфата [4]. При прямой обработке Е триэтиламинсульфатным комплексом при двухкратном избытке экдистероида в течение часа при комнатной температуре образуется смесь 2-, 22-моносульфатов и 2,22-дисульфата Е с выходами 22.0, 20.5 и 14.0 %. Для получения индивидуальных сульфатов были применены ацетатная и изопропилиденовая защиты. Использование изопропилиденовой защиты 2,3-диольной группировки позволило селективно ввести сульфатную группу в 22-е положение Е: после кислотного гидролиза трифторуксусной кислотой был получен конечный продукт с количественным выходом практически 96 %. Введение сульфатной группы в положение 25 2,3,22-триацетата 20Е достигается с трудом из-за низкой реакционной способности третичной гидроксильной группы. Данные литературы свидетельствуют, что в реакциях получения ацетатов 20Е наиболее быстро ацетилируется его 2b-гидроксигруппа из-за сравнительно незатрудненной экваториальной конформации. Кроме того, ацетилирование 2b-оксигруппы облегчается наличием соседней свободной оксигруппы. В свою очередь, С22-ОН является более реакционно-способной, чем С3-ОН [1]. Нами были получены экспериментальные подтверждения различной реакционной способности гидроксильных групп 20Е в реакциях его ацилирования ангидридами карбоновых кислот. Так, при ацилировании избытком уксусного ангидрида были получены 2,3,22-триацетат (выход 31 %), 2,3,22,25-тетраацетат (63 %). При эквимольном соотношении 20Е и уксусного ангидрида нами была получена смесь моно- и полиацетатов, из которой хроматографическими методами был выделен 2-ацетат 20Е с выходом 15 %. Для идентификации структуры природного витикостерона Е из Serratula sogdiana был проведен [3] встречный синтез 25-ацетата 20Е с защитой диольных групп в положениях 2,3- и 20,22- в виде диизопропилиденового производного (выход 0.3 %). Другим способом получения [3] 25-ацетата является гидролиз 2,3,22,25-тетраацетата 20Е водным раствором гидрокарбоната калия (выход 6.6 %). В синтезе экдистероида с длинной боковой цепью на основе циастерона удалось [7] селективно защитить 20,22-диольную группу в виде фенилбората, а 2,3-диол – в виде изопропилиденового производного. Предложенное сочетание защит, по нашему мнению, может быть использовано для селективного ацетилирования 20Е по положениям 22 или 25. Из всех конъюгатов экдистероидов с высшими жирными кислотами наибольший интерес представляют 22-производные 20Е, как наиболее часто встречающиеся в природных объектах (гидроксильная группа при С22 является очень важной для проявления максимальной биологической активности). Продукты реакции 20Е с пальмитиновым ангидридом (1.4-кратный избыток) в абсолютном пиридине при 50 оС в течение пяти часов были идентифицированы методами 1ЯМР-cпектроскопии и масс-спектрометрии как 2-пальмитат (60.0 %), 22-пальмитат (2.5 %), а также следовые количества 3-пальмитата и дипальмитатов 20Е [5]. Это свидетельствует о том, что методом прямого ацилирования с высоким выходом (более 50 %) могут быть получены моноэфиры в цикле по положению С2. При обработке 20Е 25-кратным избытком хлорангидрида пальмитиновой кислоты нами в качестве основного продукта было получено 2,3,22-трипальмитоильное производное 20Е. Получение 22-производных с высшими жирными кислотами облегчается при использовании в качестве исходного соединения экдизона, поскольку в его структуре отсутствует 20-я гидроксильная группа. Достаточно ввести изопропилиденовую группу в положение 2,3-; из оставшихся свободными групп наиболее реакционноспособная – 22-ОН, которая и вступает в реакцию ацилирования [6]. Анализ данных литературы и проведенные эксперименты показали, что получение производных 20Е в боковой цепи в положениях 22 и 25 затруднено, и введение заместителей в эти позиции требует использования эффективных методов защиты диольных групп. Результатом наших исследований стала разработка пятистадийной схемы получения производных 20-гидроксиэкдизона с карбоновыми кислотами по 22- или 25-му положениям боковой цепи с защитой диола в положении С2/С3 в виде изопропилиденового производного и диольного фрагмента при С20/С22 – в виде фенилборатного производного (рис. 2). На основе схемы удалось впервые синтезировать 22-ацетат 20-гидроксиэкдизона, а также существенно увеличить выход 25-ацетата 20-гидроксиэкдизона, что было подтверждено методом 1Н-ЯМР спектроскопии. Использование разработанной нами методики селективной химической трансформации 20Е для получения производных с различными замещающими фрагментами (высшими жирными кислотами, гликозидами, диглицеридами, амфифильными полимерами) открывает широкие возможности для синтеза, идентификации и исследования свойств природных соединений и их синтетических аналогов. ЛИТЕРАТУРА 1. Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды: химия и биологическая активность. – Минск: Наука и техника, 1989. 325 с. 2. Биомиметический принцип конструирования экдистероидсодержащих липосом / Л.А. Ковлер, В.В. Володин, Н.К Политова и др. // Докл. РАН, 1998. Т. 363. № 5. С. 641-644. 3. Зацны И.А., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдизоны Serratula. Витикостерон Е из Serratula sogdiana и его частичный синтез // Химия природных соединений, 1973. № 2. С. 175-178. 4. Analysis of ecdysteroid conjugates: chroma-tographic characterization of sulfates, phosphates and glucosides / J. Pis, J.-P. Girault, V. Grau et al. // Eur. J. Entomol., 1995. Vol. 92. № 1. P. 41-42. 5. A new class of apolar ecdysteroid conjugates: esters of 20E with long-chain fatty acids in ticks / P.A. Diehl, J.-L. Connat, J.-P. Girault, et al. // Intrn. J. Invertebrate Reprod. Develop., 1985. Vol. 8. P. 1-13. 6. Dinan L. The chemical synthesis of ecdysone 22-long chain fatty acyl esters in high yield // J. Steroid Biochem., 1988. Vol. 31. № 2. P. 237-245. 7. Guedin-Vuong D., Nakatani Y., Ourisson G. Ecdysteroids. Selective protections and synthesis of potential tools for biochemistry studies // Croatica Chem. Acta, 1983. Vol. 38. № 4. P. 547-557. 8. Koolman J. Ecdysteroids // Zool.Science, 1990. Vol. 7. P. 563-580. 9. Regioselective synthesis of 20-hydroxyecdysone glycosides / J. Pis, J. Hykli, M. Budesinsky et al. // J. Chromatogr., 1992. Vol. 596. P. 180-197. 10. Slama K., Lafont R. Insect hormones – ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol., 1995. Vol. 92. P. 355-377. v
Логотип -
Начало -
Общие
сведения -
Структура -
Научная деятельность 3786 посещений с 03.04.2001 |